Традиционно считается, что желудочно-кишечный тракт (ЖКТ) эмбрионов птиц стерилен [1–3], а формирование микробиоценоза пищеварительной системы птенцов происходит после вылупления в результате контакта с окружающей средой [4–6]. Однако существуют отдельные публикации, полученные с использованием классических микробиологических методов [7, 8], а также ПЦР в реальном времени [9], демонстрирующие, что микроорганизмы способны колонизировать ЖКТ птиц на стадии эмбрионального развития внутри яйца.
Вопрос изучения состава микроорганизмов ЖКТ эмбрионов кур остается дискуссионным, поскольку результаты публикуемых исследований весьма немногочисленны и направлены в основном на изучение патогенной для человека микрофлоры.
До 90-х годов прошлого столетия исследования микроорганизмов в разных экосистемах были ограничены изучением культивируемых штаммов на искусственных питательных средах. Существенно расширить понимание состава микробиоты позволило развитие метагеномных методов изучения микроорганизмов, важной особенностью которых можно считать отсутствие необходимости в культивировании микроорганизмов [10]. Этот момент является принципиальным в понимании существующего биоразнообразия, поскольку до 99% микроорганизмов биосферы не поддаются культивированию на искусственных питательных средах, но при этом могут играть важную экологическую роль [6]. Сведений о составе микробиома ЖКТ куриных эмбрионов, полученных с помощью метагеномного анализа, в доступной литературе мы не обнаружили.
Целью работы было выявление состава и структуры микробных сообществ ЖКТ куриных эмбрионов в период инкубации с использованием метода определения полиморфизма длин концевых рестрикционных фрагментов (T-RFLP, terminal restriction fragment length polymorphism).
Материал для исследования представлял собой две среднесмешанные пробы содержимого ЖКТ трех куриных эмбрионов кур кросса “Хайсекс Уайт” и трех куриных эмбрионов кур кросса “Хайсекс Браун” 16-суточного периода инкубации. Яйца инкубировали в инкубатории ГНУ Всероссийского научно-исследовательского и технологического института птицеводства.
Отбор проб и подготовку образцов проводили в молекулярно-генетической лаборатории “ООО БИОТРОФ+” со строгим соблюдением стерильности в соответствии с требованиями [11].
Структура метагеномных сообществ эмбрионов кур двух кроссов различалась по таксономическому составу. В ЖКТ эмбрионов кур кросса “Хайсекс Уайт” доминировали (47.3%) типичные представители кишечной микрофлоры птиц – микроорганизмы семейства Enterobacteriaceae, в котором основную долю (46.9%) составляли бактерии, относящиеся к виду Escherichia coli. В составе микробиоценоза ЖКТ эмбрионов кур кросса “Хайсекс Уайт” также были выявлены другие представители индигенной микрофлоры ЖКТ, ранее обнаруженные у вылупившихся цыплят и взрослых птиц [13], – представители порядков Actinomycetales (13.6%), Bifidobacteriales (20.6%), а также семейства Lachnospiraceae (1.1%).
Амило- и протеолитические бактерии порядка Actinomycetales, целлюлозолитические микроорганизмы семейства Lachnospiraceae, обитая в ЖКТ вылупившихся цыплят и взрослых птиц, играют значительную роль в процессах метаболизма, принимая активное участие в ферментации протеина, крахмала и полисахаридов кормов. Представители порядка Bifidobacteriales, продуцируя в ЖКТ птиц органические кислоты и бактериоцины, обеспечивают колонизационную резистентность микробиотопа в отношении патогенной микрофлоры, а также синтезируют эссенциальные нутриенты [1].
Таким образом, колонизация ЖКТ бактериями, отвечающими за адаптацию организма птицы к внешней среде, происходит уже на стадии эмбрионального развития. При этом в метагеномном сообществе ЖКТ эмбрионов кур кросса “Хайсекс Уайт” отсутствовали типичные представители автохтонной симбиотической кишечной микрофлоры птиц – факультативно-анаэробные бактерии порядка Lactobacillales, тогда как в ЖКТ эмбрионов кур кросса “Хайсекс Браун” данные микроорганизмы были выявлены в количестве 0.44%. Обладая активной способностью к кислотообразованию, данные микроорганизмы выполняют функцию конкурентного вытеснения представителей патогенной микрофлоры в ЖКТ вылупившихся цыплят и взрослых птиц [1]. Внутри порядка Lactobacillales доля микроорганизмов рода Lactobacillus sp. составляла 0.16%, рода Tetragenococcus sp. – 0.25%, рода Enterococcus sp. – 0.04%.
Кроме того, в ЖКТ эмбрионов кур обоих кроссов было обнаружено некоторое количество генотипов неидентифицированных бактерий. В метагеномном сообществе ЖКТ эмбрионов кур кросса “Хайсекс Браун”доминировали бактерии порядка Rickettsiales (94,8%) – патогены, переносчиками которых являются представители типа Arthropoda.
Помимо представителей порядка Rickettsiales в ЖКТ куриных эмбрионов был обнаружен ряд других опасных патогенов: бактерий родов Staphylococcus sp., Pseudomonas sp., Bordetella sp., Salmonella sp., Klebsiella sp. и др.
Стоит отметить, что бактерии рода Staphylococcus sp., Pseudomonas sp. и E.coli, обнаруженные нами в ЖКТ эмбрионов во время инкубационного периода, способны вызывать омфалит (пупочно-желточная инфекция) – опасное заболевание, которое является основной причиной смертности цыплят, начиная с момента вылупления до 14 дней жизни [14]. Бактерии рода Bordetella – это возбудители заболеваний респираторного тракта птиц, в основном цыплят раннего возраста [15]. Вероятно, предпосылкой к возникновению описанных заболеваний является неблагоприятный состав микрофлоры ЖКТ, сопровождающийся увеличением численности вышеназванных патогенов, на стадии эмбрионального развития птиц.
Результаты наших исследований совпадают с данными Babaca [8], изучившего 3000 образцов содержимого ЖКТ куриных эмбрионов из инкубаторов трех птицеводческих фабрик с использованием классических микробиологических высевов. Эксперименты проводились с целью выяснения причин массовой гибели куриных эмбрионов. Оказалось, что спектр микроорганизмов, способных вызвать гибель эмбриона, разнообразен: большой удельный вес составляли бактерии E. coli (18.28%), Staphylococcus sp. (14.10%), Pseudomonas sp. (11.75%), Klebsiella sp. (9.4%).
Кроме того, опубликованы данные, свидетельствующие о том, что микрофлора несушки играет ключевую роль в формировании патогенной микробиоты ЖКТ эмбриона [9]. С использованием метода ПЦР в реальном времени исследователями показано, что в ЖКТ эмбрионов, полученных от кур-несушек, искусственно зараженных Campylobacter coli, содержание данных микроорганизмов составляло 4.35–5.65 тыс. клеток/г массы тела.
Таким образом, становление новой микробиоэкологической системы птиц (содержимое ЖКТ в совокупности с населяющей его микрофлорой) происходит уже на стадии эмбрионального развития. Вероятно, структура микробиотопа ЖКТ эмбриона формируется под влиянием микрофлоры несушки путем вертикальной передачи с помощью бактериальной транслокации. Другим вероятным источником микрофлоры, колонизирующей ЖКТ куриных эмбрионов, могут являться поры в оболочке яйца. Микроорганизмы, присутствующие в ЖКТ эмбриона, являются основой, которая определяет формирование стартового кишечного биоценоза вылупившихся цыплят.
Исследование выполнено при поддержке гранта Российского научного фонда для реализации научного проекта 14–16–00140 “Современные представления о микрофлоре кишечника птицы при различных рационах питания: молекулярно-генетические подходы”.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Тимошко М.А. Микрофлора пищеварительного тракта сельскохозяйственных животных // Кишинев: «Штиинца». 1990. 161 С.
2. van der Wielen P.W.J.J., Keuzenkamp D.A., Lipman L.J.A., van Knapen F., Biesterveld. Spatial and temporal variation of the intestinal bacterial community in commercially raised broiler chickens during growth // Microbiol. Ecology 2002. V. 44. P. 286-293.
3. Maiorka A., Dahlke F., de Azevedo Morgulis M.S.F. Broiler adaptation to post-hatching period // Ciência Rural. 2006. V. 36. P. 701-708.
4. Mead G.C. Microbes of the avian cecum: types present and substrates utilized // J. Exp. Zool. Suppl. 1989. V. 3. P. 48-54.
5. Amit-Romach E., Sklan D., Uni Z. Microflora Ecology of the Chicken Intestine Using 16S Ribosomal DNA Primers // Poult. Science. 2004. V. 83. P. 1093-1098.
6. Dibner J.J., Richards J.D., Knight C.D. Microbial imprinting in gut development and health // J. Appl. Poult. Res. 2008. V. 17. P.174-188.
7. Kizerwetter-Świd M., Binek M. Bacterial microflora of the chicken embryos
and newly hatched chicken // Journal of Animal and Feed Sciences. 2008. V. 17. P. 224–232.
8. Babaca Z. Isolation of bacterial pathogens from dead-in-shell chicken embryos from local hatcheries // J. Veterinar Sci Technol. 2014. V. 5, №2. P. 170-171.
9. Rossi D. A., Fonseca B. B., de Melo R. T., da Silva Felipe G., da Silva P. L., Mendonça E. P., Filgueiras A. L. L., Beletti M. E.. Transmission of Campylobacter coli in chicken embryos // Brazilian Journal of Microbiology. 2012. V. 43, №2. P. 535-543.
10. Amann R.I., Ludwig W., Schleifer K.H. Phylogenetic identification and in situ detection of individual microbial cells without cultivation // Microb. Rev. 1995. V. 59. P. 143–169.
11. Инструкция по санитарно-микробиологическому контролю тушек, мяса птицы, птицепродуктов, яиц и яйцепродуктов на птицеводческих и перерабатывающих предприятиях. М., утв. Госкомпродом СССР 30.08.1990.
12. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование. М.: «Мир». 1984. 480 с.
13. Nakphaichit M., Thanomwongwattana S., Phraephaisarn C., Sakamoto N., Keawsompong S., Nakayama J., Nitisinprasert S. The effect of including Lactobacillus reuteri KUB-AC5 during post-hatch feeding on the growth and ileum microbiota of broiler chickens // Poult Sci. 2011. V. 12, №90. P. 2753-2765.
14. Lowder B.V., Fitzgerald J.R. Human origin for avian pathogenic staphylococcus aureus // Virulence. 2010. V. 4, №1. P. 283-284.
15. Biberstein E.L., Hirsh D.C. Bordetella in Veterinary microbiology // Blackwell Science, Inc. Oxford, Reino Unido. 1999. P. 148-150.